实验前准备：
一 溶液配制
1 Running buffer 1XTris-Glycine Buffer +0.1%SDS
2 Transfer buffer 1XTris-Glycine Buffer +20%methonal 4度保存
3 丽春红 商业
4 TBST 1XTBS+0.1%Tween 20
5 Blocking buffer 1XTBST+5% skin-milk
6 primary Ab dilution buffer 1XTBST+5% BSA+0.02% NaN3叠氮钠
7 seconding Ab dilution buffer 1XTBST+5% skin-milk
8 1.0M Tris-HCL(PH 6.8)
91.5M Tris-HCL(PH 8.8)
10 30% 聚丙稀酰胺
11 10% SDS
12 10% 过硫酸铵
13 TEMED
溶液配制见附件
二 仪器及物品
SDS-PAGE电泳仪，转膜槽，海绵2块，滤纸4块，PVDF膜一张，短玻棒一支
实验步骤
一 蛋白样品准备
蛋白样品中加入2X蛋白上样buffer，混匀后95度沸水煮样5-10分钟。3500rpm，离心1分钟后放置冰上待用。预染marker煮5min。
二 制胶
6%分离胶 >80KD
8%分离胶 50-80KD
10%分离胶 20-50KD
12%分离胶 20KD
15%分离胶 <20KD
浓缩胶 5%
配制表见附件：
配制：一块分离胶 5ml， 一块浓缩胶 1.5ml
1 提前清洗好玻璃板，并保持干燥，放置在制胶架上待用。
2配制分离胶，根据目的蛋白的分子量选择合适浓度的胶。用1ml移液器将分离胶溶液吸至玻璃板内，并用异丙醇封胶，室温放置30-1h，待胶凝固后倒掉异丙醇，用双蒸水清洗胶面，并用滤纸吸去多余的水。
3 配制浓缩胶，用移液器吸至玻璃板中，插上样品梳。室温1h左右，待胶凝固后方可使用。
三 SDS-PAGE电泳
1 将胶板固定后，加入少许水看是否漏水，如不漏水，改加Running buffer.
2 将胶槽放入电泳槽中，加入Running buffer。拔去样品梳。
3 点样，如看不清胶孔可先加入少许1X上样buffer，然后用注射器吹去buffer.需注意加入蛋白样品时缓慢加入。
4 有多余的样孔时需加上相同体积的上样buffer。
5 注意正负极，电泳的电压 浓缩胶一般为 30-80V 20分钟，分离胶50-120V 至蛋白Marker跑开。
四 转膜
1 在电泳结束前20min开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备4张滤纸（裁8cm就行）和1张PVDF膜。切滤纸和膜要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。
2将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。在加有转膜液的托盘里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸，浸泡10min左右，为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。
3平放转移槽的底座，依次在电极上叠放2张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜、刚刚完成电泳的凝胶和另外2张浸泡过缓冲液的滤纸。用玻璃棒在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。注意：电极黑色面放在最下面，然后放海绵，滤纸，胶，PVDF膜，滤纸，海绵。扣上转移槽后，黑色面为负极需对应转膜仪的负极（黑面对黑面）。
4 在转膜槽外周加冰块，防止转膜温度太高。
5加入转膜液； 装好电极，于恒定电压100V下，90-120min；
6. 丽春红染膜后，根据蛋白Marker的分子量，剪下含目的蛋白的膜并剪去一角以标记。
7. 用TBST洗去丽春红；洗3次左右；
五 封闭：
1加入5％脱脂奶粉，常温摇床摇1h；
2. TBST洗膜，10min，共3次，
六 免疫杂交反应
1 加入一抗(一抗用1XTBST+5% BSA+0.02% NaN3稀释) 置于4℃摇床摇过夜；
2 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；
3加入二抗(二抗用5％脱脂奶粉＋TBST稀释)，常温摇床摇1h；
4 TBST洗膜，10min，共3次；
七 化学发光（ECL），显影
1. 将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合（注意吸完A试剂后吸B试剂前要换枪头）将膜置于发光液中浸泡约3min；
2. 将膜铺于凝胶成像系统成像板上，拍照，拍照时选取合适的曝光时间以获得满意的图片。
附件：
SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制
1．30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N-N’-亚甲双丙烯酰胺 1g
溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。
注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。
（2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。
（3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。
2．3M Tris-HCl,pH8.8（用于分离胶）
Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.034×105 Pa，20min高压灭菌，RT贮存。
注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.
(2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。
3．2M Tris-HCl,pH6.8（用于积层胶）
同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。
4．10%十二烷基硫酸钠（SDS）
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
注：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。
5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。
6．10%过硫酸胺
过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。
方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。
7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X（running buffer）
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
SDS 10.0g
ddH2O to 1L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 0.1%SDS,)
8. 转膜缓冲液Transfer Buffer(10×) pH8.3
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
20%v/v methanol (Fresh!)
ddH2O to 1 L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)
9. TBST(10X) pH: 7.5
Tris base 24.2g
NaCl 80.0g
Tween-20 10 ml
ddH2O to 1L
(1X conc: 100mM Tris base, 150mM NaCl, 0.1%Tween20)
10．Tris缓冲盐溶液（1X TBS，25mmol/L Tris）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tris碱 3.0g
溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在15lbf/in2(1.034×105 Pa)，高压下灭菌20min，RT贮存。
11．封闭液
脱脂奶粉 5g 加入 100ml TBST中混匀。
